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Lucie Bard et la migration du cône de croissance...
 
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Un travail initié par Lucie Bard lors de son stage de Master 2, et complété par des expériences d’Olivier Thoumine, en collaboration avec le groupe de René-Marc Mège à Paris qui a fourni les réactifs moléculaires indispensables. Le contexte général est lié à la migration du cône de croissance qui intervient dans le développement du système nerveux. Cette structure motile en forme de patte d’oie située à l’extrémité des axones, permet une reconnaissance de l’environnement et un guidage des axones lors de l’établissement (et la réparation) des fibres nerveuses qui relient les différentes régions du cerveau entre elles. La motilité est assurée par un cytosquelette d’actine extrêmement dynamique, qui se comporte comme un « polymère actif », impliquant des processus de polymérisation, dépolymérisation et des mécanismes moteurs sous le contrôle de protéines associées. L’ensemble de ces processus crée ce qu’on appelle le flux rétrograde de filaments d’actine, qui bougent de l’avant vers l’arrière à la manière d’une chenille de char (« treadmilling » en anglais). Ce concept est contre intuitif car, paradoxalement, la cellule progresse vers l’avant !

Lucie bard  
Bard L, Boscher C, Lambert M, Mège RM, Choquet D, Thoumine O. A molecular clutch between the actin flow and N-cadherin adhesions drives growth cone migration. J Neurosci. 2008 Jun 4;28(23):5879-90
Lucie Bard est étudiante en thèse dans l'équipe de Daniel Choquet, elle nous présente cet article et la génése de ce travail avec Olivier Thoumine* .
 
En mouvement : une forme de patte d'oie à l'extrémité des axones en reconnaissance de terrain ! c'est l'établissement des fibres nerveuses qui vont relier les différentes "cartes" du cerveau...
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Expériences   Explication du concept
d' embrayage moléculaire


Le cône de croissance s’accroche à la matrice extracellulaire et aux cellules environnantes via des protéines de membrane spécifiques, dites protéines d’adhérence, par exemple les cadhérines ou les IgCAMs (« immunoglobulin cell adhesion molecules »). Ces protéines sont capables de former entre elles des adhésions plus ou moins labiles, mais aussi de communiquer avec le cytosquelette via des protéines associées et des voies de transduction spécifiques. Une question clé est celle de la connexion entre le flux d’actine et les processus d’adhérence. Un modèle postulé par Tim Mitchison et Paul Forscher est celui de « l’embrayage moléculaire », qui propose que l’ancrage transmembranaire à un substrat rigide permette de stopper localement ce flux rétrograde d’actine, laissant la composante de polymérisation intacte. L’actine pousse alors contre la membrane plasmique et permet la progression du cône de croissance jusqu’à ce qu’une nouvelle zone d’adhésion soit formée. Cela dit, il existe peu de données expérimentales ayant permis de valider ce modèle, notamment en ce qui concerne les cadhérines.

la Méthodologie spécifique de ce travail .

Lucie Bard et Olivier Thoumine

Nous étudions depuis plusieurs années la dynamique des interactions entre protéines d’adhérence neuronales, qui sont à la base de la plasticité des contacts entre le cône de croissance et les cellules environnantes. Nous avons notamment mis au point un système biomimétique constitué de microsphères de latex recouvertes de molécules d'adhésion recombinantes, manipulées par pinces optiques (un faisceau laser infrarouge focalisé par un objectif de microscope), pour former des contacts spécifiques avec des neurones hippocampiques primaires.Ce système présente l’avantage de pouvoir contrôler le temps initial de contact ainsi que la densité et le type de ligand sur les microsphères, ce qui n’est pas possible dans le cas d’adhésions spontanées entre neurones, qui se forment à des moments arbitraires et où plusieurs types de molécules d’adhésion peuvent coexister dans des stoechiométries inconnues.
  Par ailleurs, nous exprimons dans les neurones des molécules d’adhérence fusionnées à des protéines fluorescentes (GFP, DsRed), pour étudier leur redistribution dynamique, et utilisons des techniques d'imagerie de fluorescence (photo-blanchiment, photoactivation, suivi de Quantum dot individuels) pour sonder les processus de diffusion latérale des récepteurs ainsi que les cinétiques et les forces des interactions moléculaires ligand-récepteur et récepteur-cytosquelette au niveau de ces contacts adhésifs.

Vos lien avec les travaux antérieurs de l’équipe ?

Par exemple, en collaboration avec J. Falk et C. Faivre-Sarrailh (Marseille) nous avons disséqué les mécanismes moléculaires responsables du couplage entre le récepteur d'adhésion neuronal NrCAM et le cytosquelette d'actine, qui impliquent à la fois des interactions avec des partenaires spécifiques (ankyrine, SAP102) et l'association aux radeaux lipidiques (Falk et al., Mol Biol Cell 2004). Puis, en utilisant des constructions NrCAM-GFP tronqués dans leurs régions extracellulaires ou cytoplasmiques et marqués avec des Quantum Dots, nous avons montré que la mobilité latérale d'un récepteur est inversement corrélée à sa taille, mais que cette mobilité joue peu sur la vitesse à laquelle ces récepteurs s'accumulent au niveau d'un contact adhésif (Thoumine et al. Biophys J 2005). En collaboration avec M. Lambert et R.M. Mège (Paris), nous avons montré que les liens homophiles N-cadhérines sont constamment recyclés, avec une dynamique plus faible que ce qui avait été mesuré précédemment sur des molécules isolées, et que ce renouvellement est finement régulé par les caténines (Thoumine et al., Mol Biol Cell, 2006). Enfin, grâce à l’utilisation d’une protéine de fusion L1-GFP clivable par la thrombine et réalisée par le groupe de T. Galli (Paris), nous avons montré que le recyclage des adhésions L1 dépend en grande partie d’un trafic sélectif via des processus d’endo/exocytose (Dequidt et al., Mol Biol Cell 2007).

Quel est le contenu spécifique de l’article ?
Nous validons par un faisceau d’expériences qu’un embrayage moléculaire entre le flux d’actine et les adhésions Ncadhérine est clairement responsable de l’avancée des cônes de croissance des neurones d’hippocampe.
  Nous avons d’une part mesuré la vitesse de migration des cônes de croissance sur un substrat recouvert de N-cadhérine purifiée (film 1) et d’autre part, le couplage entre des billles recouvertes de N-cadhérine et le flux d’actine (film 2). Les billes sont déposées par pinces optiques sur la surface dorsale du cône de croissance pendant quelques secondes, permettant l’adhérence avec les récepteurs N-cadhérine endogènes. L’ancrage entre cette adhésion initiale au flux d’actine se manifeste par un mouvement dirigé de la bille vers la base du cône de croissance (Figure, panel du haut, trajectoire en bleu). Nous avons déterminé un index quantitatif du couplage et avons montré qu’il corrèle parfaitement avec la vitesse d’avancée du cône de croissance, en jouant sur la densité de N-cadhérine, sur l’expression de récepteurs N-cadhérine mutés, ou de siRNA contre les partenaires caténines permettant le couplage à l’actine.
De plus, en utilisant les pinces optiques pour imposer des forces sur les contacts à faible densité de ligand, nous avons montré un phénomène de glissement ou « patinage » des adhésions qui ne se couplent plus au flux d’actine. A forte densité de ligand, nous avons utilisé une micro-aiguille pour empêcher la bille de migrer vers l’arrière (Figure, panel du milieu). Dans cette situation qui mime un environnement rigide, nous observons une accumulation ponctuelle d’actine qui pourrait participer à l’avancée du cône.

Perspectives
C'est un travail de recherche fondamental , quelles en sont les perspectives ?
A priori, très fondamental oui ! mais il ne faut pas oublier que ces phénomènes de migration à la base du guidage axonal sont indispensables à la bonne architecture du système nerveux et peuvent intervenir dans des situations de réparation ou pathologiques. Par exemple, des mutations génétiques dans la protéine d’adhérence L1 ou dans les partenaires caténines de la N-cadhéine, sont liées à des certaines formes de retard mental et l’hydrocéphalie. Par ailleurs, des défauts dans les protéines d’adhérence neurexine/neuroligine sur lesquelles nous travaillons actuellement dans un contexte de synaptogénèse, sont impliqués dans l’autisme.

  *Olivier Thoumine est chargé de recherche au CNRS ; Université Bordeaux 2, dans l'équipe "Dynamique de l'organisation membranaire des récepteurs" de Daniel Choquet, Unité 5091 "Physiologie cellulaire de la synapse" de Christophe Mulle

Com Yves Deris 13 Juin 2008
   
   
   
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