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...On s’est alors spontanément focalisés sur notre domaine d’expertise, qui est l’élucidation de la dynamique des interactions entre protéines au niveau des contacts neuronaux, en particulier les synapses, en mettant l’accent sur les méthodes de microscopie optique qui permettent de mesurer ces interactions. On a travaillé en discontinu plusieurs mois sur ce projet pour aboutir à l’article final, qui est un véritable pavé intégrant les contributions de nombreuses personnes de l’équipe (Helge Ewers, Grégory Giannone, Laurent Groc,), mais aussi du CPMOH (Laurent Cognet et Brahim Lounis), de la plate forme d’imagerie PICIN (Christel Poujol et Philippe Legros) et des collaborateurs externes de Magdeburg (Martin Heine, Renato Frishknecht) venus faire des manips à Bordeaux. Je les remercie tous ici pour leur apport, notamment à un moment difficile où on avait un bon mois de retard sur le planning. Quel en est le contexte scientifique ? Olivier Thoumine Au cours du développement du système nerveux, de multiples contacts adhésifs entre neurones se font et se défont pour permettre l’établissement des trajets neuronaux. Ces phénomènes aboutissent à la formation de synapses permettant l’échange d’information entre neurones. Les post-synapses qui nous intéressent plus particulièrement ici, sont constituées d’assemblages macromoléculaires complexes, composés de récepteurs de neurotransmetteurs et de protéines d’adhésion, de protéines d’échafaudage et de transduction du signal, et enfin d’éléments du cytosquelette. Des études récentes ont montré que les synapses, qu’on croyait a priori relativement stables, peuvent se réorganiser rapidement à la fois au niveau morphologique et fonctionnel. En effet, les composants synaptiques sont en constant renouvellement, à l’état basal, mais également lors des processus de modification de l’efficacité de la transmission synaptique, à la base des processus d’apprentissage, de mémorisation et de réparation chez l’adulte. Les règles qui régissent ces équilibres dynamiques sont encore mal connues. Toutefois, l’utilisation de techniques d’imagerie dynamique ces dernières années a permis de montrer que l’établissement et le fonctionnement des synapses font intervenir une mobilité structurale permanente, qui repose sur des processus de diffusion, de recrutement, et de recyclage des différents partenaires protéiques. |
Pourquoi la chimie ? Olivier Thoumine Cette homéostasie requiert un contrôle fin et dynamique des interactions moléculaires en jeu. La compréhension de ces mécanismes nécessite un ensemble de nouvelles approches notamment issues de la chimie pour pouvoir quantifier les cinétiques d’établissement et de recyclage des contacts neuronaux, leur régulation par les paramètres biologiques et physiques déterminants, et éventuellement les perturber. Le but ultime serait de mesurer des réactions biochimiques à l’échelle d’une synapse individuelle. Comment est structuré cet article ? Olivier Thoumine On a choisi d’illustrer séquentiellement les différentes méthodes optiques pour mesurer les cinétiques des interactions moléculaires au niveau des contacts neuronaux. On a décrit d’abord l’ensemble des techniques disponibles pour suivre en « live » une protéine d’intérêt, soit avec des anticorps contre la protéine endogène qu’on greffe à une nanosonde type Quantum dot ou particule d’or, soit en la fusionnant avec une protéine fluorescente (de multiples variants sont disponibles avec différentes possibilités spectrales). I. Dans une première partie, nous décrivons la méthode des pinces optiques lesquelles, appliquées au piégeage de microsphères de latex recouvertes de protéines d’adhérence et en combinaison avec le « time lapse fluorescence microscopy », nous ont permis récemment de mesurer les cinétiques d’interactions entre protéines d’adhérence neuronales IgCAM et N-cadherin (Thoumine et al., BJ, 2005 ; MBC 2006 ; Dequidt et al., MBC 2007). Ces molécules forment des interactions homophiles et hétérophiles via leur domaine extracellulaire, et s’associent via leur domaine cytoplasmique à des partenaires spécifiques qui permettent de moduler leur fonction et d’établir un lien avec le cytosquelette d’actine. Ces molécules d'adhésion et leurs partenaires jouent un rôle essentiel dans la structuration du cerveau, notamment dans la croissance axonale et la synaptogénèse. Par exemple, des anomalies dans le gène codant pour L1 sont responsables de formes héréditaires de retard mental et d'hydrocéphalie chez l'homme.Une mutation de la δ-caténine, un modulateur de la N-cadhérine impliqué dans le contrôle de l'arborisation dendritique, est corrélée avec un retard mental chez l'homme et des défauts cognitifs chez la souris. |
Nous avons aussi montré en utilisant une technique de Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) que le recyclage des adhésions N-cadherin est régulé par les interactions avec les partenaires caténines et que le recyclage des adhésions L1 est dépendant des processus d’endocytose et d’exocytose au niveau des cônes de croissance. Ainsi nos mesures permettent une meilleure compréhension de la chronologie d’établissement des contacts adhésifs entre neurones et ce qui régule leur dynamique. Nous détaillons par ailleurs l’utilisation de la technique de FRAP pour la mesure des temps de résidence des protéines synaptiques (récepteurs du glutamate et protéines d’échafaudage). III. Dans une dernière partie, nous traitons les techniques de « Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)» et « Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy (FCCS)», qui permettent de mesurer la diffusion moléculaire et la dynamique de réactions intermoléculaires à partir des fluctuations de signal de fluorescence émis par une petit nombre de molécules passant à travers un volume d’illumination confocal. |
Nous détaillons pour finir la mesure d’interactions moléculaires par Förster’s Resonance Energy Transfer (FRET), en particulier par la technique de Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), qui est maintenant utilisée en routine à la PICIN par C. Poujol et P. Legros. La durée de vie qu’un fluorophore passe dans l’état excité, de l’ordre de la nanoseconde, est diminuée sensiblement si ce fluorophore donneur peut transférer son énergie à un accepteur. Ceci permet une mesure directe de la proximité entre deux molécules fusionnées à des protéines fluorescentes partenaires (GFP et mCherry par exemple). Une étude complète des interactions entre stargazin, la sous-unité auxilliaire des récepteurs AMPA et la protéine d’échafaudage PSD-95, est en cours de réalisation grâce à cette technique. |
2) l’utilisation de microscopie optique haute résolution (FRET/FLIM, FCCS, suivi de particules individuelles, imagerie bi-photonique) pour l’exploitation de ces sondes chimiques dans un environnement cellulaire. L’objectif final est la fabrication d’outils fonctionnels localisés dans des sous-compartiments cellulaires spécifiques, en particulier des synapses individuelles, pour visualiser quantifier, et perturber sélectivement des interactions inter-moléculaires entre récepteurs du glutamate et des protéines d’échafaudage essentielles à la plasticité synaptique. En termes humains, ce travail constitue la continuation d’une collaboration récente avec le groupe de chimie de Barbara Imperiali (MIT, Boston) financée par le Human Frontier Science Program. Le développement d’une interface Chimie-Neuroscience va prendre une nouvelle dimension avec le recrutement de Matthieu Sainlos, chimiste bio-organicien en tant que chargé de recherche dans le groupe de Daniel Choquet. |
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