Marie Pierre Moisan dans Endocrinology Decembre 2009

La création d'un modéle animal ....
La première étape a été de créer ce modèle animal dans lequel l’expression du gène de la transcortine (Cbg) est modifiée. Pour cela, nous avons collaboré avec la Clinique de la Souris (Illkirch) qui nous a créé par recombinaison homologue dans des cellules souches une lignée de souris Cbg « floxée ». Cette lignée de souris contient des séquences loxP flanquant l’exon 2 du gène Cbg, ce qui permet de faire disparaître cet exon et donc d’abolir l’expression du gène Cbg en croisant cette souris Cbg floxée avec une souris surexprimant la recombinase Cre.

Nous avons utilisé la lignée de souris CMV-Cre afin d’obtenir des groupes de souris Cbg-/- n’ayant plus de gène Cbg fonctionnel, Cbg+/- ayant un seul allèle fonctionnel et les souris contrôles Cbg+/+. Par Western blot et PCR en temps réel nous avons pu vérifier que les souris Cbg-/- ne produisaient pas de transcortine alors que les Cbg+/- avait une expression 50% inférieure à celle des Cbg+/+. Nous avons d’abord étudié les conséquences de la déficience totale (Cbg-/-) ou partielle (Cbg+/-) en transcortine sur le fonctionnement de l’axe corticotrope.

Comme attendu, le pourcentage de corticostérone libre est fortement augmenté chez les souris Cbg-/- (~20-26%) et modérément chez les Cbg+/- (9-12%) comparées aux contrôles Cbg+/+ (7-9%) en condition de repos. En termes de concentration, le niveau de corticostérone libre est équivalent le soir (au pic de la sécrétion nycthémérale) entre les différents groupes car la concentration de corticostérone totale (comprenant la fraction libre et celle liée à la transcortine et à l’albumine) est effondrée chez les souris Cbg-/-, ce qui compense le pourcentage plus élevé.
Cette concentration diminuée de corticostérone totale n’est pas due à un défaut de sécrétion mais plutôt à une clairance de la corticostérone augmentée dans le plasma chez les souris mutantes. En accord avec la concentration de corticostérone libre inchangée, les souris déficientes en corticostérone ne montrent pas de phénotype particulier en condition basale, c’est-à-dire au repos.

Cependant après un stress, conduisant à une élévation importante de corticostérone dans le plasma, les souris déficientes en transcortine ne vont pas répondre de façon optimale. En effet, nous avons montré qu’après un stress de contrainte ou suite à un test de comportement tel que le test de la nage forcée, l’élévation de corticostérone totale et libre était moindre chez les souris déficientes en Cbg (Cbg-/- et Cbg+/-).

A première vue cela peut sembler surprenant car l’on pourrait penser qu’avec moins de transcortine la concentration de corticostérone libre serait augmentée. Cependant, il semble que la clairance accrue de corticostérone dans le plasma prime sur l’augmentation de la fraction libre de l’hormone.

Le rôle de la transcortine...
La transcortine a donc un rôle essentiel dans la constitution d’un réservoir de corticostérone (ou cortisol chez l’homme) dans le plasma nécessaire pour une réponse au stress optimale. Ainsi une déficience en transcortine conduit à une déficience de corticosterone active après stress qui va avoir des conséquences comportementales. Les souris déficientes en transcortine montrent une augmentation des comportements de résignation mesurés dans le test de la nage forcée ainsi que dans le test de résignation apprise (learned helplessness).
Ce comportement de type « dépressif » est associé a une expression diminuée du gène Egr-1 (gène en aval de la voie MAP kinase aussi appelé zif268, NGFI-A, or Krox 24) dans l’hippocampe des souris Cbg-/- et Cbg+/-, lequel gène a un rôle important dans les comportements de type dépressifs influencés par les glucocorticoïdes. Le défaut de tonus glucocorticoïde chez les souris déficientes en transcortine est aussi révélé par une expérience de sensibilisation à la cocaïne, phénomène clairement cortico-dépendant. Les souris Cbg+/- montrent une faible sensibilisation et les souris Cbg-/- ne se sensibilisent pas du tout à des injections répétées de cocaïne. En résumé nous avons montré que l’abolition totale ou à 50% de l’expression du gène de la transcortine chez la souris conduit à un défaut de glucocorticoïdes après stress, associé à des comportements de résignation.

Retombées et développements ultérieurs
Ces travaux ouvrent des perspectives intéressantes pour l’étude de la vulnérabilité génétique au stress et des pathologies associées. Nous avons montré que le gène de la transcortine présente une grande variabilité chez le porc, influençant le niveau de cortisol circulant et le taux d’adiposité.

Chez l’homme, nous avons montré que des polymorphismes du gène codant pour la transcortine était associé à l’obésité. L’importance du gène Cbg a également été observée entre souches de rat (Fisher 344 et WKY) puisqu’un groupe américain a montré, lui aussi par une approche sans hypothèse de départ, que ce gène influençait la réponse glucocorticoïde au stress avec la souche WKY montrant une affinité de la transcortine pour la corticostérone diminuée, une moindre élévation de corticostérone après stress et des comportements de type dépressifs.

Dans un contexte de neurosciences, nous sommes maintenant particulièrement intéressés par étudier les effets d’une déficience en transcortine sur l’apprentissage et la mémoire. Nous allons également étudier la neuroinflammation (en particulier le rôle des cytokines cérébrales) qui peut être induite par la déficience en glucocorticoïdes et qui influence la survenue de troubles émotionnels et cognitifs. Il nous faut également montrer qu’en compensant le niveau de corticosterone nous pouvons rétablir des comportements normaux après stress et enfin évaluer l’impact des polymorphismes du gène de la transcortine sur les réponses émotionnelles au stress chez l’homme... sans oublier la femme chez qui la réponse glucocorticoïde au stress montre des différences importantes avec celle de l’homme!

		Neuro-symphonie du stress....
		Marie Pierre Moisan, dans l'équipe de Pierre Mormède "Variabilité génétique de l'axe corticotrope, mécanismes moléculaires et conséquences physiopathologiques" fait le point sur les recherches concernant le stress et ses conséquences pathologiques et précise ses travaux à la suite d'une publication dans "Endocrinology" de ce mois de Février 2010.

		"Plasma transcortin influences endocrine and behavioral stress responses in mice." Richard EM, Helbling JC, Tridon C, Desmedt A, Minni AM, Cador M, Pourtau L, Konsman JP, Mormède P, Moisan MP. Endocrinology. 2010 Feb;151(2):649-59. Epub 2009 Dec 18.

			Transcortin as a Genetic Factor of Stress Vulnerability (Marie Pierre Moisan, english resume)

		Marie Pierre Moisan, physiologiquement comment se traduit le stress et dans quel contexte se situe votre publication ? Marie Pierre Moisan Ce travail s’inscrit dans le contexte général de l’étude du stress et de ses conséquences pathologiques. Le terme stress désigne à la fois l’agent stressant (stresseur) et l’ensemble des réactions physiologiques et psychiques (réponses de stress) déclenchées chez l’individu pour faire face au stresseur. Ces réponses, initiées dans le cerveau, vont induire la libération dans le sang d’hormones à partir des glandes surrénales, adrénaline et noradrénaline (catécholamines) et cortisol (glucocorticoïde) ainsi que de nombreux neuropeptides et neurotransmetteurs dans différentes structures cérébrales. L’ensemble de ces médiateurs va agir de façon interactive et coordonnée dans l’organisme afin de permettre à l’individu de s’adapter aux changements de l’environnement à court et à long termes. Le terme « neuro-symphonie du stress » a été employé par Marian Joëls (Université d’Amsterdam) pour qualifier cette fine orchestration des réponses de stress. Ce sont les réponses de stress excessives ou inadéquates qui vont favoriser le développement de maladies dites liées au stress : la dépression et les troubles anxieux, les maladies auto-immunes, l’obésité ou les maladies cardiovasculaires, l’addiction aux drogues, le vieillissement cérébral. On sait qu’une forte variabilité interindividuelle est observée dans la réactivité à un même stress. Cette variabilité a des origines génétiques et épigénétiques qui sont en interaction dynamique avec l’environnement auquel s’expose l’individu. La vulnérabilité ou la résistance au stress vont à leur tour influencer l'apparition de pathologies associées au stress. Notre équipe cherche à identifier les facteurs génétiques influençant les réponses de stress chez l’animal par des approches génomiques sans hypothèse de départ sur les gènes impliqués.

		Pouvez vous nous rappeler les différentes étapes qui ont jalonnées ces recherches ? Marie Pierre Moisan Dans les années 1990-1995 l’INRA a mis en place un grand projet de recherche de gènes influençant des traits agronomiques chez le porc. Pierre Mormède et une étudiante (Céline Désautés) ont participé à ce projet en étudiant la réactivité comportementale et endocrinienne au stress de plus de 600 porcelets issus d’un croisement entre deux races se distinguant entre autres pour leur niveau de cortisol avant et après stress. L’étude génétique réalisée avec ces mesures de stress et des marqueurs balayant l’ensemble du génome avait mis en évidence de façon très significative un locus génomique sur le chromosome 7 expliquant 20% de la variabilité des niveaux de cortisol après stress.

		Le génome porcin n’étant pas encore séquencé à l’époque c’est par comparaison des segments de chromosomes conservés avec le génome humain que nous avons supputé que le gène codant pour la transcortine (aussi appelée corticosteroid binding globulin = CBG) se trouvait dans le locus du chromosome 7 défini par notre analyse génétique . Ce gène était un très bon candidat fonctionnel puisque 90% du cortisol plasmatique circule sous forme d’un complexe avec la transcortine. Celle-ci a de ce fait un rôle important dans la biodisponibilité de l’hormone car seuls les 10% de cortisol libre sont actifs sur leurs récepteurs dans les organes cibles. Dans une étude publiée en 2004, nous avons cloné ce gène chez le porc et vérifié que sa localisation chromosomique était bien dans l’intervalle défini par les marqueurs de l’analyse génétique. Nous avons également apporté des données génétiques et biochimiques appuyant l’hypothèse que le gène de la transcortine était le gène responsable du locus associé aux niveaux de cortisol. Dans l’étude présentée ici, nous « bouclons la boucle » en créant un modèle animal dans lequel est modifiée spécifiquement l’expression du gène de la transcortine afin d’étudier son impact sur les réponses de stress.

		La création d'un modéle animal .... La première étape a été de créer ce modèle animal dans lequel l’expression du gène de la transcortine (Cbg) est modifiée. Pour cela, nous avons collaboré avec la Clinique de la Souris (Illkirch) qui nous a créé par recombinaison homologue dans des cellules souches une lignée de souris Cbg « floxée ». Cette lignée de souris contient des séquences loxP flanquant l’exon 2 du gène Cbg, ce qui permet de faire disparaître cet exon et donc d’abolir l’expression du gène Cbg en croisant cette souris Cbg floxée avec une souris surexprimant la recombinase Cre. Nous avons utilisé la lignée de souris CMV-Cre afin d’obtenir des groupes de souris Cbg-/- n’ayant plus de gène Cbg fonctionnel, Cbg+/- ayant un seul allèle fonctionnel et les souris contrôles Cbg+/+. Par Western blot et PCR en temps réel nous avons pu vérifier que les souris Cbg-/- ne produisaient pas de transcortine alors que les Cbg+/- avait une expression 50% inférieure à celle des Cbg+/+. Nous avons d’abord étudié les conséquences de la déficience totale (Cbg-/-) ou partielle (Cbg+/-) en transcortine sur le fonctionnement de l’axe corticotrope. Comme attendu, le pourcentage de corticostérone libre est fortement augmenté chez les souris Cbg-/- (~20-26%) et modérément chez les Cbg+/- (9-12%) comparées aux contrôles Cbg+/+ (7-9%) en condition de repos. En termes de concentration, le niveau de corticostérone libre est équivalent le soir (au pic de la sécrétion nycthémérale) entre les différents groupes car la concentration de corticostérone totale (comprenant la fraction libre et celle liée à la transcortine et à l’albumine) est effondrée chez les souris Cbg-/-, ce qui compense le pourcentage plus élevé. Cette concentration diminuée de corticostérone totale n’est pas due à un défaut de sécrétion mais plutôt à une clairance de la corticostérone augmentée dans le plasma chez les souris mutantes. En accord avec la concentration de corticostérone libre inchangée, les souris déficientes en corticostérone ne montrent pas de phénotype particulier en condition basale, c’est-à-dire au repos. Cependant après un stress, conduisant à une élévation importante de corticostérone dans le plasma, les souris déficientes en transcortine ne vont pas répondre de façon optimale. En effet, nous avons montré qu’après un stress de contrainte ou suite à un test de comportement tel que le test de la nage forcée, l’élévation de corticostérone totale et libre était moindre chez les souris déficientes en Cbg (Cbg-/- et Cbg+/-). A première vue cela peut sembler surprenant car l’on pourrait penser qu’avec moins de transcortine la concentration de corticostérone libre serait augmentée. Cependant, il semble que la clairance accrue de corticostérone dans le plasma prime sur l’augmentation de la fraction libre de l’hormone. Le rôle de la transcortine... La transcortine a donc un rôle essentiel dans la constitution d’un réservoir de corticostérone (ou cortisol chez l’homme) dans le plasma nécessaire pour une réponse au stress optimale. Ainsi une déficience en transcortine conduit à une déficience de corticosterone active après stress qui va avoir des conséquences comportementales. Les souris déficientes en transcortine montrent une augmentation des comportements de résignation mesurés dans le test de la nage forcée ainsi que dans le test de résignation apprise (learned helplessness). Ce comportement de type « dépressif » est associé a une expression diminuée du gène Egr-1 (gène en aval de la voie MAP kinase aussi appelé zif268, NGFI-A, or Krox 24) dans l’hippocampe des souris Cbg-/- et Cbg+/-, lequel gène a un rôle important dans les comportements de type dépressifs influencés par les glucocorticoïdes. Le défaut de tonus glucocorticoïde chez les souris déficientes en transcortine est aussi révélé par une expérience de sensibilisation à la cocaïne, phénomène clairement cortico-dépendant. Les souris Cbg+/- montrent une faible sensibilisation et les souris Cbg-/- ne se sensibilisent pas du tout à des injections répétées de cocaïne. En résumé nous avons montré que l’abolition totale ou à 50% de l’expression du gène de la transcortine chez la souris conduit à un défaut de glucocorticoïdes après stress, associé à des comportements de résignation. Retombées et développements ultérieurs Ces travaux ouvrent des perspectives intéressantes pour l’étude de la vulnérabilité génétique au stress et des pathologies associées. Nous avons montré que le gène de la transcortine présente une grande variabilité chez le porc, influençant le niveau de cortisol circulant et le taux d’adiposité. Chez l’homme, nous avons montré que des polymorphismes du gène codant pour la transcortine était associé à l’obésité. L’importance du gène Cbg a également été observée entre souches de rat (Fisher 344 et WKY) puisqu’un groupe américain a montré, lui aussi par une approche sans hypothèse de départ, que ce gène influençait la réponse glucocorticoïde au stress avec la souche WKY montrant une affinité de la transcortine pour la corticostérone diminuée, une moindre élévation de corticostérone après stress et des comportements de type dépressifs. Dans un contexte de neurosciences, nous sommes maintenant particulièrement intéressés par étudier les effets d’une déficience en transcortine sur l’apprentissage et la mémoire. Nous allons également étudier la neuroinflammation (en particulier le rôle des cytokines cérébrales) qui peut être induite par la déficience en glucocorticoïdes et qui influence la survenue de troubles émotionnels et cognitifs. Il nous faut également montrer qu’en compensant le niveau de corticosterone nous pouvons rétablir des comportements normaux après stress et enfin évaluer l’impact des polymorphismes du gène de la transcortine sur les réponses émotionnelles au stress chez l’homme... sans oublier la femme chez qui la réponse glucocorticoïde au stress montre des différences importantes avec celle de l’homme!
		Contact / mpmoisan@bordeaux.inra.fr

		com Yves Deris Fev 2010